产品内容：

注意：I型（HZ008）为超声裂解法，II(HZ009)型为酶解法。均适用于可溶性和包涵体中His标签蛋白的纯化。

产品说明：

1.重组蛋白 N 端的 GST 谷胱甘肽 S 转移酶（Glutathione S Transferase）能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用 GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化 GST 标记蛋白质的重要方法。

2.只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没形成包涵体的 GST 标记蛋白。

3.提供 5 mL 浓度为 50%的谷胱甘肽-Agarose 介质，可吸附 5-20 mg GST标记蛋白质。

4.本试剂盒可用于2次GST蛋白纯化（50mL 体积的细菌)。

操作步骤：

一：重组蛋白的表达和细菌收集

1. 37℃振荡培养 50 mL 含表达质粒的细菌到 OD600=0.6-0.8。 

2. 加 IPTG 到终浓度为 0.1 mM，30℃振荡培养 3 h 或 22℃振荡培养 8 h（或过夜）。 

3. 4℃ 5000 g 离心 10 min 收集 50 mL 表达菌液，弃上清。

4. 用30 mL 1×PBS 缓冲液重悬细菌沉淀，4℃ 5000 g 离心 10 min，弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。 

二： 谷胱甘肽层析柱的准备

1.将谷胱甘肽-琼脂糖介质充分混匀后，取2.5 mL加入到预放了一片筛板的层析柱中。

2.用 7.5 mL 预冷的洗涤液洗柱，共三次。

三： 裂解

(1)超声破碎细菌：在50mL 的细菌沉淀中加入 2.5 mL 冰浴的超声裂解缓冲液，再加入 125 uL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。

(2)酶法裂解细菌：加入 2.5 mL 冰浴的酶解液，再加入 125 uL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上放置 30 分钟。

四：纯化

1.将超声或酶法得到的细胞裂解物在 13，000 g 4℃离心 10 min去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性 GST 标记蛋白。预留少量（如 100uL）作为裂解液留样，其余用于纯化。

2. 将上清液加入谷胱甘肽层析柱中，层析柱预先用盖子将底端的漏液口堵上。让细菌裂解液和介质在 4℃结合 1-12 h 后放开底端的盖子让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 电泳。

注意：可将穿透液重新加入此层析柱中，以提高结合率。

3.用 10 mL 1×PBS 缓冲液洗柱，收集并保存穿透液（含杂蛋白）并预留100uL 作为穿透液留样，其余在确认实验成功后再丢弃。

4.用 0.2-0.5 mL GST 洗脱液洗柱，收集并保存穿透液，此穿透液即纯化的GST 标记蛋白样品。由于它可能含蛋白酶污染，所以纯化样品不能在 4℃长期放置，需留 100uL 左右用于后续浓度测定或/和 SDS-PAGE 电泳，其余放-80℃长期放置。

5.用裂解液留样（四-1）、穿透液留样（四-3）和纯化样品留样（四-4）进行蛋白定量或/和 SDS-PAGE 分析。

注意：本操作没有预先脱盐，故只能用 Bradford 法或 OD 检测法测定裂解液留样、穿透液留样和样品留 样的蛋白浓度。按 OD 检测法，1 OD280 约等于 0.5 mg/mL 蛋白。由于GST 的分子量为 26 KD，所以在 SDS-PAGE 胶上，GST 标记蛋白将比天然蛋白大 26 KD。

五：谷胱甘肽层析柱的恢复资料（自备试剂）

1. 用 3 倍介质体积的 6 M 盐酸胍处理柱子 10 分钟。介质为 2mL 则用 6mL，下同。

2. 用 3 倍介质体积的超纯水处理柱子 10 分钟。

3. 用 3 倍介质体积的缓冲液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）处理柱子 10 分钟。

4. 用 3 倍介质体积的缓冲液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）处理柱子 10 分钟。

5. 再重复 3-4 步两次。

6. 用 3 倍介质体积的超纯水处理柱子 3 次。

7. 若需要立即使用，则用 3 倍介质体积的 1×PBS 缓冲液处理柱子 2 次。堵上漏口，加 3 倍介质体积的 1×PBS 缓冲液洗涤后立即使用。