多重荧光免疫组化技术(Multiplex immunohistochemical，mIHC) 也称作酪氨酸信号放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技术，是一类利用辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP) 对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。
该方法基于酪胺信号放大的多重顺次免疫染色技术，允许同时检测单个细胞或组织样本上的多个目标靶点，全面研究细胞组成、细胞功能和细胞间相互作用。
mIHC 实验原理及流程
TSA 技术采用 HRP 标记的二抗，HRP 催化加入体系的 TSA 衍生荧光染料，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，将信号共价结合到抗原上。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。
mIHC 借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色[2]。
Tips：
原理：带有染料标记的底物酪胺 (T) 分子在过氧化氢氧化环境下，被抗体或探针固定的 HRP 转化为具有短暂活性的中间状态 (T*)，然后被激活的中间态分子 (T*) 迅速与相接蛋白分子的富含电子区域 (酪氨酸残基) 进行稳定的共价结合，未被标记的酪胺分子将被洗脱，借此实现对抗原的特异性染色。由于相接的蛋白 (包括 HRP，抗体，目标抗原) 都含有大量的酪氨酸结合位点，所以目标抗原处会富集大量标记分子，使信号被有效放大 (图 2)。
■ IHC 与 mIHC
免疫组化，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性的研究。
：简单来说，mIHC 属于 IHC 的升级版本！
Tips：
相同点：能够完整显现组织原位形态信息。
不同点：
1. 常规免疫组化的分析属于定性分析，其判断大多依赖于经验，其分析结果会有差异。而多重荧光免疫组化属于定量分析，其利用软件可对组织中的细胞进行精准的结果分析。
2. 常规免疫组化受传统染色成像的限制，靶标少于 3 个，无法完整分析组分信息。而多重荧光免疫组化可实现多因子共定位，可以获取更多的生物信息，且样本需求量较少。
图 4. 癌组织单色 IHC（上）和多色谱 mIHC（下）验证[3]
■ mIHC 与 IF
那么问题来了，mIHC 与 IF 又有什么区别呢？既然最后的成像都是荧光图像，那按照 IF 实验就行哇，为什么要去做 mIHC 呢？？？
：其实，mIHC 作为一种新型的免疫化学技术，其价值自然会优于传统的 IF 实验，并且二者在原理及操作步骤上均有差异。
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图 3. mIHC（左）和常规三色荧光检测示意图（右）
应用实例
■ 应用一：肿瘤机制探究
Gang Wei 等人收集了透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 患者的肾周脂肪 (Perinephric adipose tissue, PAT) 和皮下白色脂肪 ( White adipose tissue,WAT) 组织样本，发现肿瘤邻近脂肪细胞的解偶联蛋白 1 (Uncoupling protein 1, UCP1) 表达高于远端脂肪细胞（WAT 褐变的典型特征之一是 UCP1 的表达上调）。
此外，肿瘤细胞的 qRT-PCR、mIHC 检测和免疫印迹均表明，在联合注射 BAC-shPgc1a或 BAC-shUcp1 相关的肿瘤中，脂肪细胞促进的 UCP1 水平上调被抑制(图 4)。
进一步的研究发现，ccRCC 细胞分泌甲状旁腺激素相关蛋白 PTHrP 以通过 PKA 激活促进 PAT 褐变，而 PAT 介导的产热导致过量乳酸的释放以增强 ccRCC 的生长、侵袭和转移色[2]。
图 4. UCP1 水平变化的检测[4]
mIHC (A), qRT-PCR (BG) and Immunoblotting (C) 检测 UCP1 水平。空白对照组：786-O; 阴性对照组：786-O+BAC-Scramble；敲低 Pgc1a 实验组：786-O+ BAC-shPgc1a；敲低Ucp1实验组：786-O+ BAC-shUcp1。
■ 应用二：免疫抑制性肿瘤微环境鉴定
Halse, H 等人运用 mIHC 对转移性黑色素瘤中的免疫亚群进行精准定位，数据量化了肿瘤内 (Intra-tumor, IT) 与肿瘤基质 (Peri-tumoral, stroma) 的免疫亚群数量，以及免疫亚群与 (Tumor margin, TM) 的距离。
如图所示，使用 mIHC 在特定肿瘤区域分析转移性黑色素瘤中免疫亚群的精确位置，观察不同免疫亚群在瘤内的表达情况。结果显示，对于黑色素瘤的 MelTIL026 (盆腔淋巴结) 切片，大多数 T 细胞为 CD4+T 细胞，且在肿瘤边缘 (TM) 和间质区域 (S) 突出，在肿瘤内 (IT) 区域 CD4+和 CD8+T细胞数量较少。
MCE 提供用于 mIHC 所需要的 Vari Fluor TSA 系列染料 ，可用于高密度原位标记检测。Vari Fluor TSA 系列通过辣根过氧化物酶 (HRP) 靶向抗原，基于酪胺的信号放大技术能够提供极强的灵敏度、检测极微量的目的抗原。荧光波长范围较窄，可以很好的避免 mIHC 实验中的串色影响。
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货号 |
产品名称 | Ex/Em (nm) |
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Vari Fluor 350 TSA（200×） |
347/448 |
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Vari Fluor 488 TSA（200×） |
490/515 |
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Vari Fluor 532 TSA（200×） |
527/558 |
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Vari Fluor 555 TSA（200×） |
555/565 |
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Vari Fluor 594 TSA（200×） |
590/617 |
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Vari Fluor 640 TSA（200×） |
617/639 |
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| HY-D1831 | Vari Fluor 620 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1833 | Vari Fluor 680 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1839 | Biotin TSA（200×） | / |
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参考文献
[1] Taube JM, et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation [published correction appears in J Immunother Cancer. 2020 Jun;8(1):]. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000155.
[2] Tan WCC, et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 2020;40(4):135-153.
[3] Zhang W, et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 2021;68(6):1272-1282.
[4] Wei G, et al. The thermogenic activity of adjacent adipocytes fuels the progression of ccRCC and compromises anti-tumor therapeutic efficacy. Cell Metab. 2021;33(10):2021-2039.e8.
[5] Halse H, et al. Multiplex immunohistochemistry accurately defines the immune context of metastatic melanoma. Sci Rep. 2018;8(1):11158. Published 2018 Jul 24.